2. PRP 치료법
간단히 정의하면 자신의 혈소판과 백혈구의 생물학적 자극(biostimulation)에 의해 자신의 손상 조직을 재생시키는 자가혈 세포 재생 (autologous cellular regeneration) 방식이다.
3. 혈소판
1. 혈소판 구조(platelet structure)
혈소판은 골수의 거대 핵세포(megakaryocytes)가 세포 분절을 통해 만들어진 무핵의 세포 조각이며 엄밀한 의미에서 세포가 아니라 단순한 세포 절편이다. 거대 핵세포 1개 에서 약 1000개의 혈소판을 방출한다.
혈소판은 적혈구 직경의 약 20%에 불과하며 혈액 1µL 당 15만~35만개 정도가 들어 있다.
1)알파 과립
성장인자를 방출시켜 손상 조직 치유를 중재한다.
혈소판의 알파 과립은 싸이토카인, 케모카인(chemokines) 그리고 세포 증식, 세포 성숙, 염증분자 조절, 백혈구를 유인하는 다양한 단백질의 출처로 작용한다. 또한 항균 및 항진균 단백질을 저장하여 감염을 방지하고, metalloprotease-4 등 단백질 분해 효소(proteases)와 혈액 응고 인자를 함유한다.
2) 조밀과립(dense granule)
ADP, ATP, 칼슘 이온, 히스타민, 세로토닌, 도파민을 저장하고 방출시키고
3) 용해소체 과립(lyzosomal granules)
또한 조직 치유 과정에 일정 역할을 하는 분자 물질을 분비한다.
혈소판에는 알파 과립(alpha granules), 조밀 과립(dense granules), 리조솜(lyzosomes) 등 3곳의 주요 저장 구획이 존재하여
성장 인자(growth factor),
응고 단백질(coagulation proteins),
유착 분자(adhesion molecules),
세포 활성 분자(cell-activating molecules), 싸이토카인(cytokines),
인테그린(integrins),
염증성 분자 물질 (inflammatory molecules) 등을 내포하고 있다.
2. 기능(function)
● 지혈작용
● 창상치유
1) 창상 치유에 관여하는 성장인자 및 싸이토카인은 대부분 알파 과립에 들어 있지만 조밀 과립에 포함된 serotonin, histamine, dopamine, calcium, adenosine 등도 창상 치유에 중요한 기능을 한다. 히스타민과 세로토닌은 모세 혈관 투과성을 증가시키고 손상 부위에 다핵 백혈구 등 염증 세포를 이동시키고 대식세포를 자극하며 아데노신 수용체 활성은 창상 회복 과정에서 염증을 조절하기 때문이다.
혈소판이 손상 부위에 집합, 응집되면 활성화되어 혈소판 내 과립 내용물을 세포외 배출(exocytosis) 과정을 통해 방출시킨다. 성장 인자 농도는 혈소판 농도와 비례하여 증가된다.
혈소판은 매우 가벼워 혈류의 변방, 즉 혈관 내피를 따라 순환한다. 혈관 내피는 테플론(Teflon)처럼 매우 평활한 표면을 지니고 있어 어떠한 혈류 내 물질이라도 부착시키지 않지만
혈관 내피층이 손상되거나 혈관벽을 둘러싸는 섬유가 혈액에 노출되면 맨 먼저 혈소판이 이를 감지하여 그 부위에 달라붙어 활성화된다. 혈소판은 이물질 표면에 달라 붙거나 혈소판끼리 함께 부착되는 본디 성질이 있기 때문이다.
혈관 손상 초기에는 혈소판 덩어리가 혈관 벽 섬유에 달라 붙어 출혈을 차단하는 밀봉제로 작용한다. 혈소판이 활성화되면 혈소판 형태가 변화하면서 다양한 생물학적 활성 물질을 방출한다.
혈소판은 근육 단백질과 유사한 단백질을 함유하며 이 단백질이 서로 달라 붙을 때 형태가 변화하는 것이다.
혈액은 적혈구, 백혈구, 혈장, 혈소판으로 구성된다.
혈소판은 평소에 해면처럼 보이지만 활성화되면 분지(分枝)되어 치유 단백질인 성장인자를 방출, 조직의 창상 치유를 촉진한다. 따라서 이들 혈소판 농도를 증가시키면 극적으로 조직을 복구시키는 성장호르몬 칵테일을 기대할 수 있다. 정상 혈소판 형태는 접시 형태(왼쪽 사진)를 취하기 때문에 platelet(작은 접시)라는 이름이 붙어 있다. 혈관벽이 파열되어 혈소판이 자극되면 접시형태에서 구형으로 변화되면서 손상 부위(혈관벽)까지 문어처럼 기다란 촉수(tentacle) 또는 Pseudo-pod(假足)를 뻗어 내거나 다른 혈소판과 서로 뒤엉킨다(나머지 우측 3개 사진) 혈소판은 이 같은 기다란 섬유소로 파괴된 혈관을 밀봉시키는 plug을 형성한다.
2) 혈소판 성장인자(Platelet growth factors) 및 기능
혈장에는 혈액 응고인자 및 기타 단백질 그리고 이온들을 함유한다.
혈소판 내 과립체에는 세포 증식 및 분화, 화학주성, 혈관신생, 세포 내 기질 침착, 면역 세포 소집, 항균 활성, 재형성 (remodeling)등 조직 수복(tissue repair)의 전 과정에 관여하는 60여 종류의 생물학적 활성 물질이 들어있다. 이들 생물학적 활성 물질 가운데 가장 중요한 것이 성장 인자이다.
혈소판이 활성화되면 탈과립(degranulation) 과정을 거쳐
α 입자로 부터
PDGF (plateletderived growth factor),
TGF-α & β (transforming growth factor alpha & beta),
EGF (epidermal growth factor),
FGF (fibroblast growth factor),
KGF (keratinocyte growth factor),
IGF (insulin growth factor),
PDEGF (platelet-derived epidermal growth factor), IL-8 (interleukin-8),
TNF-α (tumor necrosis factor alpha),
CTGR (connective tissue growth factor),
GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) 등 성장인자 및 기타 생물학적 활성물질이 방출되어 연조직 및 경조직의 창상 치유를 개시하고 조절하는 등 조직 형성 능력을 발휘한다. 이와 같은 기전이 바로 조직 수복을 위해 PRP를 사용하는 이론적 근거이다.
창상 치유는 매우 복잡한 과정이기 때문에 단일 요인만으론 창상 치유에 한계가 있다. 하지만 PRP는 고농도의 성장 인자 및 싸이토카인이 모두 생물학적 비율로 발현되기 때문에 성장인자들 간 상호 작용을 통해 상처 치유 촉진 효과가 탁월한 것으로 알려져 있다.
PRP에는 PDGF를 비롯하여 고 농도의 TGF-beta 1, VEGF 등 성장인자를 함유하며 혈소판이 활성화되면 활성화된 성장인자가 방출되어 주변에 화학적 신호를 발령함으로써 고유 기능을 발휘한다.
☆ 성장인자 출처 기능
PDGF 혈소판 세포 증식, 혈관 생성, 섬유아 세포 분열 촉진
VEGF 혈소판 혈관 생성
TGF-ß1 혈소판 섬유화와 근세포 재생간 균형을 조절하는 핵심 인자
FGF(fibroblast growth factor) 혈소판 근육모 세포(myoblast) 증식 및 혈관 생성 자극
EGF(epidermal growth factor) 혈소판 중간엽 세포, 상피 세포 증식 및 기타 성장인자 강화
HGF(hepatocyte growth factor) 혈장 혈관생성, 내피세포 분열 촉진, 항 섬유화 기능
IGF-1(Insulin-like growth factor) 혈장 근육모 세포 및 섬유아 세포 자극, 골격근 성장 및 수복을 매개
① PDGF(platelet derived growth factor)
PDGF는 모든 창상 치유를 개시한다. 상처 치유의 초기 단계부터 발현되기 시작, 상처 치유의 전 과정에 필수적이다. 모든 창상 치유의 근본인 줄기세포와 혈관 내피 세포 증식을 자극, 새로운 모세 혈관을 생성(angiogenesis)하여 창상으로 출아(出芽)시킨다. 단핵구, 중성구, 섬유아 세포, 골아 세포 등에 대한 화학 주성이 있어 혈관 주변의 치유 관련 세포의 창상 이동을 촉진하고 기타 성장 인자 효과를 조절하기도 한다. 섬유아 세포, 근육 세포 분화를 촉진하고 상처 치유 과정 중 혈관 생성, 섬유 세포 형성, 재상피화에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한 IGF와 TGF-β와 함께 골격계 치유 과정을 조절하는 중추적 역할을 담당한다. PDGF는 또한 진피 재생을 촉진한다. 국소적으로 단백질 및 collagen 합성을 촉진하고 내피세포 이동 및 혈관신생 등을 유발할 뿐 아니라(Ross, 1987) TGF-beta 발현을 유도하기도 한다(Pierce 등.1989)
② TGF-beta(transforming growth factor)
섬유아 세포(fibroblasts)는 TGF-beta에 의해 활성화된다. 섬유아 세포가 활성화되면 세포 분열을 유발하고 collagen을 생성한다. collagen이 침착되면 피부가 팽팽해지고 노화의 육안적 중후를 개선시킨다. TGF-beta는 치유 개시, 종료, 분화 및 증식을 촉진하는 등 대부분의 조직 창상 수복 과정에 영향을 미친다(Chio & Fucks, 1990)
③ VEGF(vascular endothelial growth factor) VEGF는 상처 치유의 증식 시기부터 발현되어 혈관 신생에 기여하는 것으로 보고되어 있고 혈관 재생을 촉진하여 만성적인 상처 치유를 촉진하고 골내골화를 돕는 것으로 알려져 있다. 특히 VEGF는 아주 적은 농도에서 세포분화를 촉진시킨다. 하지만 고농도에서는 오히려 골 형성을 방해하는 것으로 알려져 있다.
4. PRP 제조 방법
응고된 전혈에서 투명한 액체가 혈청이다.
거의 모든 혈액 세포와 응고 단백질이 응고 반응에 소진되기 때문에 혈청 내에는 혈소판이 존재하지 않아 PRP를 만들어 낼 수 없다. 따라서 PRP 제조를 위해서는 응고 되지 않은 혈액이 요구된다.
전혈에 citrate를 첨가하면 citrate가 혈중에 존재한 이온화 칼슘을 부착시켜 버리기 때문에 혈액 응고 연쇄반응을 차단한다.
이 상태에서 원심 분리 과정을 거친다.
1. separating(분리)
원심분리 과정은 적혈구층, 백혈구 및 혈소판 층(buffy coat),혈장층으로 분리한다. 적혈구 (직경 7 μm) 및 백혈구 크기(직경 7~15 μm)는 혈소판(직경 2 μm)보다 훨씬 크기 때문에 원심 분리하면 혈구가 혈장 및 혈소판과 분리된다.
2. condensation(농축)
원심 분리 과정은 1 차 원심 분리로 생긴 혈소판을 더욱 농축시켜 혈소판 부족 혈장(PPP)과 혈소판 풍부 혈장(PRP)으로 분리한다. 미국 FDA에서 승인한 PRP preparation 방법은 citrate dextrose로 항 응고 처리한 전혈을 채혈한 후 2단계의 원심 분리를 통해 혈소판 부족 혈장(Platelet poor plasma), 적혈구, PRP aliquot를 분리하는 것이다. 정상인은 당 혈소판 숫자가 평균 20만개 정도이다, 하지만 혈소판이 치료 효과를 발휘하기 위해서는 적어도 약 5배 정도 농축되어야 한다. 그러나 실제로는 PRP 제작에 사용된 장비나 방식에 따라 다양한 혈소판 농도를 나타내기 때문에 임상 효과에도 큰 차이를 보이고 있다.
그림 3. 혈장 내 혈소판 숫자가 uL당 5만개 이하일 때 혈소판 부족 혈장(platelet-poor plasma, PPP)이라고 하며 PRP preparation을 제조할 때 부산물로 파생된다. PPP또한 fibrinogen 수준이 증가되어 있기 때문에 일단 활성화되면 피브린 풍부 응괴(fibrin rich clot)를 형성할 수 있다. 피브린 응괴(fibrin clot) 또한 세포 이동(cell migration)과 부착(attachment) 과정을 유도하여 창상 치유를 촉진시킨다.
RMS PRP Preparation System에 의한 PRP제조 방법 RMS Korea에서 개발, 제공하는 PRP Preparation System은 Marx protocol을 근간으로 하여 혈소판 농축율을 극대화시킬 수 있는 원심분리 시스템과 채혈관, 커넥터 등으로 구성된다.
● RMS PRP Preparation System
(1)RMS PRP Preparation System 구성 ①원심분리기(Angle rotor type, 6,000 RPM, 3,420 G )
②채혈관(2등급)
③항응고제(C.T.G)
④응고 촉진 및 혈소판 활성화제: Dirabine(bovine thrombin), Calmia(calcium gluconate)
⑤10ml, 3ml, 1ml 일반주사기 각1개 ⑥19gauge주사침
⑦알코올 솜 전용 원심분리기 Placon Plus 전용 PRP 시약 PRP 전용 채혈관
그림 4.
(2) RMS PRP Preparation System의 PRP 제조 방식 Marx protocol(Marx RE 등; Platelet rich plasma - Growth factor enhancement for bone grafts. J Oral Maxillofac Surg Vol 85 No.6 June 1998)에 근거한 방식이다.
① 채혈관에 1ml의 C.T.G 를 투입한 후 혈액 10ml 를 antecubital region에서 무균적으로 채혈한다. 혈소판을 자극하지 않고 혈소판 손상을 최소화하기 위해 비교적 직경이 큰18~19 G 바늘을 사용하여 채취한 혈액 내 혈소판이 비교적 비활성 상태로 존재하도록 한다. C.T.G성분은 anhydrous citric acid, sodium citrate hydrate, dextrose 등이다. 그림 5.(2장입니다)
② 채혈관 대칭 작업 후 1차 원심분리를 시작한다(2,000G/4,188 RPM X 5분).
그림 6.(2장입니다)
③ 1차 원심 분리한 다음 채혈관에 커넥터를 부착하고10ml주사기를 연결하여 RBC를 제거한다
그림 7.
④ 채혈관 대칭 작업 후 2차 원심분리 (3,400G/5,129 RPM X 8분)
그림 8. (2장입니다)
⑤ 2차 원심 분리한 후 다시 채혈관에 커넥터를 부착시키고 1ml 또는 3ml 주사기를 이용하여 PRP 1ml를 채취한다 그림 9.
⑥ PRP 1ml 에 디라빈, 칼미아 혼합액(0.1ml) 을 투입한 후 약 20초가 경과되면 PRP가 젤화(gelation)되어 혈소판 젤(platelet gel)이 된다. 혈소판 젤은 개방 창상이나 피부에 도포 방식으로 사용된다. 점도가 높아 주사 바늘을 통해 주입하기 어렵기 때문이다. 칼미아 성분은 calcium gluconate hydrate이다. 그림 10.
⑦ 젤화된 PRP를 20초간 흔들어주면 액화된다. 액화된 activated PRP는 주사 바늘을 통해 병변 부위에 주입할 수 있다. 그림 11.(2장입니다)
5. 역사
PRP 연구는 1970년대에 시작되었지만 PRP를 임상에 처음 적용시킨 것은 구강 외과 및 정형 외과 의사들이었다. 1997년 구강 및 악안면 수술 시 PRP 병용 치료 효과가 소개된 후(Whitman 등), 연조직 및 경조직 치유 및 재생을 단축시키기 위해 다양한 수술에 동원되었고 그 사용 범위 또한 날로 확장되었다.
2000년대에 들어서서 근육 및 건, 인대 손상, 골절, 골 이식 및 퇴행성 골 질환 치료에 기대 이상의 효과가 알려지기 시작했고 Pittsburgh Stealers의 Heinz Ward, 프로 골퍼 Tiger Woods 등 유명 선수의 스포츠 손상 치료를 획기적으로 단축시켜 운동 선수의 현장 복귀를 앞당긴 사례가 알려지면서 PRP 관련 연구는 더욱 활발해지고 있으며 일반 대중들에게도 ‘피 주사’라는 이름으로 익숙해져 가고 있다.
6. 기타
PRP 관련 용어를 리뷰하면 혈소판 풍부 농축물(platelet-rich concentrate), 혈소판 젤(platelet gel), 성장 인자 풍부 제제(PRGF, preparation rich in growth factors), 혈소판 방출물(platelet relesate), 혈소판 농축물(platelet concentrate) 등은 모두 PRP와 유사한 의미로 통용되고 있다. 하지만 이 가운데 Platelet concentrate는 혈장 성분을 배제하고 혈소판이라는 고형 성분만의 농축물이라는 의미이기 때문에 PRP와 동의어로 혼용하는 것은 문제가 있다.
#prp
#혈소판
#혈소판풍부혈장
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